深度測序深入剖析人類機體整套免疫系統(tǒng)的功能

從研究者Susumu Tonegawa（利根川進(jìn)）及同事發(fā)現(xiàn)哺乳動物免疫系統(tǒng)的抗體多樣性秘密到現(xiàn)在已經(jīng)過去40多年了；早在1978年，日本科學(xué)家Tonegawa就通過利用相對較低分辨率的工具發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞可以從大量收集的可變（V）、多樣性（D）及連接（J）基因片段中有效地選擇一個來產(chǎn)生功能性的抗體基因，同時研究者還可以通過剔除插入到基因組中的DNA來將上述基因片段連接起來，而這被稱之為體細(xì)胞重組。

研究者Susumu Tonegawa因“發(fā)現(xiàn)抗體多樣性的遺傳學(xué)原理”獲得了1987年的諾貝爾學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，然而細(xì)胞如何行使這些基因組操作工作依然是個謎題，如今非常感謝新一代的DNA測序技術(shù)使得這些機制重新被科學(xué)家們所關(guān)注，同時表觀遺傳學(xué)信號似乎也會影響偏遠(yuǎn)基因組元件的成環(huán)和重排的能力。

在一項研究中，來自英國巴布拉漢研究所(Babraham Institute)的研究人員Anne Corcoran和其同事就利用了一種名為VDJ-Seq的方法，結(jié)合高通量測序技術(shù)ChIP-seq及其它測序技術(shù)揭示了VDJ重組事件中V基因使用背后的表觀遺傳因素；VDJ重組即H鏈可變區(qū)的D基因的任一段與J基因拼成DJ基因后再與V基因任一段相結(jié)合而形成新基因的過程。

此外，來自伊利諾伊大學(xué)的研究者Amy Kenter又利用染色體構(gòu)象俘獲（3C）的高通量突變體解析了免疫球蛋白區(qū)域的染色體架構(gòu)信息；上述這兩項研究表明，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及染色體構(gòu)象在機體全部免疫系統(tǒng)形成中的復(fù)雜重要角色。

VDJ-Seq方法的圖表

遺傳偏差

小鼠的免疫球蛋白重鏈區(qū)包含了195個V基因，10個D基因以及4個J基因，其跨越了3Mb長度的基因組DNA，這些基因片段可以隨機重組產(chǎn)生7800種基因組合方式，而且，每個重組片段中的隨機核苷酸插入以及剔除，輕鏈基因，諸如體細(xì)胞高頻突變等機制以及抗體產(chǎn)生的數(shù)量都會呈指數(shù)形式增長，然而基因的使用或許并不是*隨機的，有些V基因相比其它基因而言卻會非常頻繁地發(fā)生重組。

研究者Corcoran推測了隱藏在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及其它表觀遺傳改變背后的結(jié)果，他表示，雖然VDJ-Seq技術(shù)在不斷變革，但他們意識到必須擁有大量的表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)才能夠在較大的免疫球蛋白區(qū)域進(jìn)行繪圖，但如今研究者并不清楚上述過程中每個基因使用的頻率如何。

VDJ-Seq技術(shù)基于引物眼神到了J區(qū)域，所以該技術(shù)可以覆蓋DNA中重組的VDJ基因組序列區(qū)域，通過捕獲來自小鼠早期階段祖B細(xì)胞(pro B cells)中的DNA，并且對相應(yīng)片段進(jìn)行測序；研究者指出，在小鼠被感染之前或暴露于病原體之前，這種新技術(shù)就可以對其機體一系列基因的使用情況進(jìn)行大范圍的普查。

在小鼠免疫球蛋白重鏈基因去的195個V基因中，128個基因都會發(fā)生頻繁重組（活性狀態(tài)），而67個基因則不會重組（失活狀態(tài)）；為了理解活性和非活性基因區(qū)域間的差異，研究小組將V基因的使用數(shù)據(jù)同18個表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（包括ChIP-seq和非編碼轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫）相互關(guān)聯(lián)，從而尋找可以預(yù)測基因重組的相關(guān)因子，zui后研究者鑒別出了兩種表觀遺傳學(xué)標(biāo)記：A和E，這兩種標(biāo)記同活性重組之間存在一定關(guān)聯(lián)，兩者并沒有參與種系的轉(zhuǎn)錄，研究者意外發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)錄或許會被認(rèn)為在重組中扮演重要角色，研究者指出，被兩種名為CTCF和RAD21轉(zhuǎn)錄因子定義的標(biāo)記可以在基因的3’端進(jìn)行結(jié)合，盡管在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)不同，但特殊標(biāo)記可以使得基因更有可能發(fā)生重組。

上述研究結(jié)果在很大程度上同2013年斯克利普斯研究所科學(xué)家Ann Feeney進(jìn)行的研究相似，Ann Feeney的研究同樣也在V基因的使用中提及了轉(zhuǎn)錄因子CTCF和RAD21，然而研究者zui終并沒有鑒別出一種簡單的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。Feeney說道，目前沒有一個參數(shù)可以表明直接的線性關(guān)聯(lián)，這并不是說如果我們有特殊的組蛋白標(biāo)記，我們就可以獲得較多的重排組合。

研究者Corcoran說道，VDJ-Seq技術(shù)僅僅是所謂的整套測序（repertoire sequencing）策略中的一種，但其卻提供了兩種關(guān)鍵的優(yōu)勢，*，VDJ-Seq不像其它方法，其可以對DNA測序而并不是RNA，盡管重組通常發(fā)生于DNA中，我們?nèi)匀恍枰獙嶒瀬碇苯佣康赜^察，從而發(fā)現(xiàn)一系列影響，包括產(chǎn)生VFJ事件的V基因之間的差異，V基因增強子以及RNA的穩(wěn)定性等，其它的優(yōu)勢就是VDJ-Seq不會在覆蓋V基因的區(qū)域出現(xiàn)偏差，而且VDJ-Seq并不依賴一系列V基因啟動子。

一個關(guān)于架構(gòu)的問題

研究者Kenter從體系結(jié)構(gòu)的角度解析了免疫球蛋白重鏈區(qū)域的奧秘，通過利用此前存在的HiC數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白重鏈區(qū)域（lgh）位于名為拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）的隔絕的染色體附近區(qū)域，隨后研究者利用高分辨率方法（5C）以及3-D熒光原位雜交（DNA FISH）揭示了lgh的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上包含有三種不同的亞結(jié)構(gòu)域或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，每一種都和近段、中間及遠(yuǎn)端的V基因家族相對應(yīng)，而且每一種都將其轉(zhuǎn)角區(qū)域鑲嵌到了CTCF及其它的B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點處，這些轉(zhuǎn)錄因子就可以“停泊”架構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

如今研究者想知道是否這些特殊的轉(zhuǎn)錄因子會影響V基因的利用（使用），他們已經(jīng)將位點壓縮同環(huán)狀結(jié)構(gòu)了其它，研究者Kenter解釋道，我們需要理解是否這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以幫助確定V基因的利用。對于研究者Corcoran而言，他們目前正在深入研究來確定新鑒別出的機制是否會影響人類機體的整個免疫系統(tǒng)。

zui后研究者Feeney說道，免疫球蛋白基因位點就是一種動態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)，在每一個B細(xì)胞中，其都會發(fā)生不同的變化，而且免疫球蛋白基因位點會發(fā)生改變，否則我們機體就不會產(chǎn)生多樣化的體系，因此我們或許并不會驚訝地發(fā)現(xiàn)多個因子會影響整個機體過程，而且還是在多個不同水平下影響的，我認(rèn)為這只是多種驅(qū)動力組合所引發(fā)的結(jié)果。